化學鍵合固定相的基本理論

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。
1.鍵合相的性質
   目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。
   殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對性溶質（特別是堿性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用*基氯硅烷（TMCS）等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的"濕潤"性能。
   由于不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量（C%）來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。
   pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。　
2.鍵合相的種類
   化學鍵合相按鍵合官能團的性分為性和非性鍵合相兩種。
   常用的性鍵合相主要有氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相。性鍵合相常用作正相色譜，混合物在性鍵合相上的分離主要是基于性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，性強的組分保留值較大。性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。
   常用的非性鍵合相主要有各種烷基（C1~C18）和苯基、苯甲基等，以C18應用zui廣。非性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。
   另外C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。
3.固定相的選擇
   分離中等性和性較強的化合物可選擇性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。
   分離非性和性較弱的化合物可選擇非性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS（octadecyl silane）是應用的非性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。
   另外，美國藥典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現；而中國藥典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。